ген кодирующий белок что это значит

ДНК и гены

ДНК ПРОКАРИОТ И ЭУКАРИОТ

Справа крупнейшая спираль ДНК человека, выстроенная из людей на пляже в Варне (Болгария), вошедшая в книгу рекордов Гиннесса 23 апреля 2016 года

Дезоксирибонуклеиновая кислота. Общие сведения

Дезоксирибонуклеи́новая кислота (ДНК) — макромолекула (одна из трёх основных, две другие — РНК и белки), обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. ДНК содержит информацию о структуре различных видов РНК и белков.

В клетках эукариот (животных, растений и грибов) ДНК находится в ядре клетки в составе хромосом, а также в некоторых клеточных органоидах (митохондриях и пластидах). В клетках прокариотических организмов (бактерий и архей) кольцевая или линейная молекула ДНК, так называемый нуклеоид, прикреплена изнутри к клеточной мембране. У них и у низших эукариот (например, дрожжей) встречаются также небольшие автономные, преимущественно кольцевые молекулы ДНК, называемые плазмидами.

С химической точки зрения ДНК — это длинная полимерная молекула, состоящая из повторяющихся блоков — нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы. Связи между нуклеотидами в цепи образуются за счёт дезоксирибозы (С) и фосфатной (Ф) группы (фосфодиэфирные связи).

Рис. 2. Нуклертид состоит из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы

В подавляющем большинстве случаев (кроме некоторых вирусов, содержащих одноцепочечную ДНК) макромолекула ДНК состоит из двух цепей, ориентированных азотистыми основаниями друг к другу. Эта двухцепочечная молекула закручена по винтовой линии.

В ДНК встречается четыре вида азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Азотистые основания одной из цепей соединены с азотистыми основаниями другой цепи водородными связями согласно принципу комплементарности: аденин соединяется только с тимином (А-Т), гуанин — только с цитозином (Г-Ц). Именно эти пары и составляют «перекладины» винтовой «лестницы» ДНК (см.: рис. 2, 3 и 4).

Рис. 2. Азотистые основания

Последовательность нуклеотидов позволяет «кодировать» информацию о различных типах РНК, наиболее важными из которых являются информационные, или матричные (мРНК), рибосомальные (рРНК) и транспортные (тРНК). Все эти типы РНК синтезируются на матрице ДНК за счёт копирования последовательности ДНК в последовательность РНК, синтезируемой в процессе транскрипции, и принимают участие в биосинтезе белков (процессе трансляции). Помимо кодирующих последовательностей, ДНК клеток содержит последовательности, выполняющие регуляторные и структурные функции.

Рис. 3. Репликация ДНК

Расположение базовых комбинаций химических соединений ДНК и количественные соотношения между этими комбинациями обеспечивают кодирование наследственной информации.

Образование новой ДНК (репликация)

По завершении дупликации образуются две самостоятельные спирали, созданные из химических соединений родительской ДНК и имеющие с ней одинаковый генетический код. Таким путем ДНК способна перерывать информацию от клетки к клетке.

Более подробная информация:

СТРОЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) относится к нуклеиновым кислотам. Нуклеиновые кислоты – это класс нерегулярных биополимеров, мономерами которых являются нуклеотиды.

НУКЛЕОТИДЫ состоят из азотистого основания, соединенного с пятиуглеродным углеводом (пентозой) – дезоксирибозой (в случае ДНК) или рибозой (в случае РНК), который соединяется с остатком фосфорной кислоты (H₂PO₃–).

Азотистые основания бывают двух типов: пиримидиновые основания – урацил (только в РНК), цитозин и тимин, пуриновые основания – аденин и гуанин.

Рис. 5. Структура нуклеотидов (слева), расположение нуклеотида в ДНК (снизу) и типы азотистых оснований (справа): пиримидиновые и пуриновые

Атомы углерода в молекуле пентозы нумеруются числами от 1 до 5. Фосфат соединяется с третьим и пятым атомами углерода. Так нуклеинотиды соединяются в цепь нуклеиновой кислоты. Таким образом, мы можем выделить 3’ и 5’-концы цепи ДНК:

Рис. 6. Выделение 3’ и 5’-концов цепи ДНК

Две цепи ДНК образуют двойную спираль. Эти цепи в спирали сориентированы в противоположных направлениях. В разных цепях ДНК азотистые основания соединены между собой с помощью водородных связей. Аденин всегда соединяется с тимином, а цитозин – с гуанином. Это называется правилом комплементарности (см. принцип комплементарности ).

Правило комплементарности:

Например, если нам дана цепь ДНК, имеющая последовательность

3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,

то вторая ей цепь будет комплементарна и направлена в противоположном направлении – от 5’-конца к 3’-концу:

5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’.

Рис. 7. Направленность цепей молекулы ДНК и соединение азотистых оснований с помощью водородных связей

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК

Репликация ДНК – это процесс удвоения молекулы ДНК путем матричного синтеза. В большинстве случаев естественной репликации ДНК праймером для синтеза ДНК является короткий фрагмент РНК (создаваемый заново). Такой рибонуклеотидный праймер создается ферментом праймазой (ДНК-праймаза у прокариот, ДНК-полимераза у эукариот), и впоследствии заменяется дезоксирибонуклеотидами полимеразой, выполняющей в норме функции репарации (исправления химических повреждений и разрывов в молекле ДНК).

Репликация происходит по полуконсервативному механизму. Это значит, что двойная спираль ДНК расплетается и на каждой из ее цепей по принципу комплементарности достраивается новая цепь. Дочерняя молекула ДНК, таким образом, содержит в себе одну цепь от материнской молекулы и одну вновь синтезированную. Репликация происходит в направлении от 3’ к 5’ концу материнской цепи.

Рис. 8. Репликация (удвоение) молекулы ДНК

ДНК-синтез – это не такой сложный процесс, как может показаться на первый взгляд. Если подумать, то для начала нужно разобраться, что же такое синтез. Это процесс объединения чего-либо в одно целое. Образование новой молекулы ДНК проходит в несколько этапов:

Рис. 9. Схематическое изображение процесса репликации ДНК: (1) Отстающая цепь (запаздывающая нить), (2) Ведущая цепь (лидирующая нить), (3) ДНК-полимераза α ( Polα ), (4) ДНК-лигаза, (5) РНК-праймер, (6) Праймаза, (7) Фрагмент Оказаки, (8) ДНК-полимераза δ ( Polδ ), (9) Хеликаза, (10) Однонитевые ДНК-связывающие белки, (11) Топоизомераза.

Далее описан синтез отстающей цепи дочерней ДНК (см. Схему репликативной вилки и функции ферментов репликации)

Нагляднее о репликации ДНК см. видео →

5) Непосредственно сразу после расплетания и стабилизации другой нити материнской молекулы к ней присоединяется ДНК-полимераза α (альфа) и в направлении 5’→3′ синтезирует праймер (РНК-затравку) – последовательность РНК на матрице ДНК длиной от 10 до 200 нуклеотидов. После этого фермент удаляется с нити ДНК.

СТРОЕНИЕ РНК

Рибонуклеиновая кислота (РНК) — одна из трёх основных макромолекул (две другие — ДНК и белки), которые содержатся в клетках всех живых организмов.

Последовательность нуклеотидов позволяет РНК кодировать генетическую информацию. Все клеточные организмы используют РНК (мРНК) для программирования синтеза белков.

Затем матричные РНК (мРНК) принимают участие в процессе, называемом трансляцией, т.е. синтеза белка на матрице мРНК при участии рибосом. Другие РНК после транскрипции подвергаются химическим модификациям, и после образования вторичной и третичной структур выполняют функции, зависящие от типа РНК.

Рис. 10. Отличие ДНК от РНК по азотистому основанию: вместо тимина (Т) в РНК представлен урацил (U), который также комплементарен аденину.

ТРАНСКРИПЦИЯ

Транскрипция – это процесс синтеза РНК на матрице ДНК. ДНК раскручивается на одном из участков. На одной из цепей содержится информация, которую необходимо скопировать на молекулу РНК – эта цепь называется кодирующей. Вторая цепь ДНК, комплементарная кодирующей, называется матричной. В процессе транскрипции на матричной цепи в направлении 3’ – 5’ (по цепи ДНК) синтезируется комплементарная ей цепь РНК. Таким образом, создается РНК-копия кодирующей цепи.

Рис. 11. Схематическое изображение транскрипции

Например, если нам дана последовательность кодирующей цепи

3’– ATGTCCTAGCTGCTCG – 5’,

то, по правилу комплементарности, матричная цепь будет нести последовательность

5’– TACAGGATCGACGAGC– 3’,

а синтезируемая с нее РНК – последовательность

3’– AUGUCCUAGCUGCUCG – 5’.

ТРАНСЛЯЦИЯ

Рассмотрим механизм синтеза белка на матрице РНК, а также генетический код и его свойства. Также для наглядности по ниже приведенной ссылке рекомендуем посмотреть небольшое видео о процессах транскрипции и трансляции, происходящих в живой клетке:

Рис. 12. Процесс синтеза белка: ДНК кодирует РНК, РНК кодирует белок

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД

Генетический код, общий для большинства про- и эукариот. В таблице приведены все 64 кодона и указаны соответствующие аминокислоты. Порядок оснований — от 5′ к 3′ концу мРНК.

Таблица 1. Стандартный генетический код

Среди триплетов есть 4 специальных последовательности, выполняющих функции «знаков препинания»:

Свойства генетического кода

1. Триплетность. Каждая аминокислота кодируется последовательностью из трех нуклеотидов – триплетом или кодоном.

2. Непрерывность. Между триплетами нет никаких дополнительных нуклеотидов, информация считывается непрерывно.

3. Неперекрываемость. Один нуклеотид не может входить одновременно в два триплета.

4. Однозначность. Один кодон может кодировать только одну аминокислоту.

5. Вырожденность. Одна аминокислота может кодироваться несколькими разными кодонами.

6. Универсальность. Генетический код одинаков для всех живых организмов.

Пример. Нам дана последовательность кодирующей цепи:

3’– CCGATTGCACGTCGATCGTATA– 5’.

Матричная цепь будет иметь последовательность:

5’– GGCTAACGTGCAGCTAGCATAT– 3’.

Теперь «синтезируем» с этой цепи информационную РНК:

3’– CCGAUUGCACGUCGAUCGUAUA– 5’.

Синтез белка идет в направлении 5’ → 3’, следовательно, нам нужно перевернуть последовательность, чтобы «прочитать» генетический код:

5’– AUAUGCUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.

Теперь найдем старт-кодон AUG:

5’– AU AUG CUAGCUGCACGUUAGCC– 3’.

Разделим последовательность на триплеты:

Найдем стоп-кодон и согласно таблице генетического кода запишем последовательность аминокислот:

Центральная догма молекулярной биологии звучит следующим образом: информация с ДНК передается на РНК (транскрипция), с РНК – на белок (трансляция). ДНК также может удваиваться путем репликации, и также возможен процесс обратной транскрипции, когда по матрице РНК синтезируется ДНК, но такой процесс в основном характерен для вирусов.

Рис. 13. Центральная догма молекулярной биологии

ГЕНОМ: ГЕНЫ и ХРОМОСОМЫ

Термин «геном» был предложен Г. Винклером в 1920 г. для описания совокупности генов, заключенных в гаплоидном наборе хромосом организмов одного биологического вида. Первоначальный смысл этого термина указывал на то, что понятие генома в отличие от генотипа является генетической характеристикой вида в целом, а не отдельной особи. С развитием молекулярной генетики значение данного термина изменилось. Известно, что ДНК, которая является носителем генетической информации у большинства организмов и, следовательно, составляет основу генома, включает в себя не только гены в современном смысле этого слова. Большая часть ДНК эукариотических клеток представлена некодирующими («избыточными») последовательностями нуклеотидов, которые не заключают в себе информации о белках и нуклеиновых кислотах. Таким образом, основную часть генома любого организма составляет вся ДНК его гаплоидного набора хромосом.

Гены — это участки молекул ДНК, кодирующие полипептиды и молекулы РНК

За последнее столетие наше представление о генах существенно изменилось. Ранее геном называли участок хромосомы, кодирующий или определяющий один признак или фенотипическое (видимое) свойство, например цвет глаз.

В 1940 г. Джордж Бидл и Эдвард Тейтем предложили молекулярное определение гена. Ученые обрабатывали споры гриба Neurospora crassa рентгеновским излучением и другими агентами, вызывающими изменения в последовательности ДНК (мутации), и обнаружили мутантные штаммы гриба, утратившие некоторые специфические ферменты, что в некоторых случаях приводило к нарушению целого метаболического пути. Бидл и Тейтем пришли к выводу, что ген — это участок генетического материала, который определяет или кодирует один фермент. Так появилась гипотеза «один ген — один фермент». Позднее эта концепция была расширена до определения «один ген — один полипептид», поскольку многие гены кодируют белки, не являющиеся ферментами, а полипептид может оказаться субъединицей сложного белкового комплекса.

Современное биохимическое определение гена еще более конкретно. Генами называются все участки ДНК, кодирующие первичную последовательность конечных продуктов, к которым относятся полипептиды или РНК, обладающие структурной или каталитической функцией.

Наряду с генами ДНК содержит и другие последовательности, выполняющие исключительно регуляторную функцию. Регуляторные последовательности могут обозначать начало или конец генов, влиять на транскрипцию или указывать место инициации репликации или рекомбинации. Некоторые гены могут экспрессироваться разными путями, при этом один и тот же участок ДНК служит матрицей для образования разных продуктов.

Мы можем приблизительно рассчитать минимальный размер гена, кодирующего средний белок. Каждая аминокислота в полипептидной цепи кодируется последовательностью из трех нуклеотидов; последовательности этих триплетов (кодонов) соответствуют цепочке аминокислот в полипептиде, который кодируется данным геном. Полипептидная цепь из 350 аминокислотных остатков (цепь средней длины) соответствует последовательности из 1050 п.н. (пар нуклеотидов). Однако многие гены эукариот и некоторые гены прокариот прерываются сегментами ДНК, не несущими информации о белке, и поэтому оказываются значительно длиннее, чем показывает простой расчет.

Сколько генов в одной хромосоме?

ДНК прокариот устроена более просто: их клетки не имеют ядра, поэтому ДНК находится непосредственно в цитоплазме в форме нуклеоида.

Как известно, бактериальные клетки имеют хромосому в виде нити ДНК, уложенной в компактную структуру – нуклеоид. Хромосома прокариота Escherichia coli, чей геном полностью расшифрован, представляет собой кольцевую молекулу ДНК (на самом деле, это не правильный круг, а скорее петля без начала и конца), состоящую из 4 639 675 п.н. В этой последовательности содержится примерно 4300 генов белков и еще 157 генов стабильных молекул РНК. В геноме человека примерно 3,1 млрд пар нуклеотидов, соответствующих почти 29 000 генам, расположенным на 24 разных хромосомах.

Прокариоты (Бактерии).

Бактерия E. coli имеет одну двухцепочечную кольцевую молекулу ДНК. Она состоит из 4 639 675 п.н. и достигает в длину примерно 1,7 мм, что превышает длину самой клетки E. coli приблизительно в 850 раз. Помимо крупной кольцевой хромосомы в составе нуклеоида многие бактерии содержат одну или несколько маленьких кольцевых молекул ДНК, свободно располагающихся в цитозоле. Такие внехромосомные элементы называют плазмидами (рис. 16).

Большинство плазмид состоит всего из нескольких тысяч пар нуклеотидов, некоторые содержат более 10000 п. н. Они несут генетическую информацию и реплицируются с образованием дочерних плазмид, которые попадают в дочерние клетки в процессе деления родительской клетки. Плазмиды обнаружены не только в бактериях, но также в дрожжах и других грибах. Во многих случаях плазмиды не дают никаких преимуществ клеткам-хозяевам, и их единственная задача — независимое воспроизведение. Однако некоторые плазмиды несут полезные для хозяина гены. Например, содержащиеся в плазмидах гены могут придавать клеткам бактерий устойчивость к антибактериальным агентам. Плазмиды, несущие ген β-лактамазы, обеспечивают устойчивость к β-лактамным антибиотикам, таким как пенициллин и амоксициллин. Плазмиды могут переходить от клеток, устойчивых к антибиотикам, к другим клеткам того же или другого вида бактерий, в результате чего эти клетки также становятся резистентными. Интенсивное применение антибиотиков является мощным селективным фактором, способствующим распространению плазмид, кодирующих устойчивость к антибиотикам (а также транспозонов, которые кодируют аналогичные гены) среди болезнетворных бактерий, и приводит к появлению бактериальных штаммов с устойчивостью к нескольким антибиотикам. Врачи начинают понимать опасность широкого использования антибиотиков и назначают их только в случае острой необходимости. По аналогичным причинам ограничивается широкое использование антибиотиков для лечения сельскохозяйственных животных.

Эукариоты.

Таблица 2. ДНК, гены и хромосомы некоторых организмов

Источник

Что такое ДНК-вакцины и с чем их едят?

Автор

Редактор

ДНК-вакцины относятся к типу принципиально новых биологических препаратов. С их разработкой связывают большие надежды на повышение эффективности профилактики не только заболеваний бактериальной, вирусной и паразитарной природы, но и аллергических, аутоиммунных и даже онкологических болезней. Более двадцати лет назад возникла идея использовать гены возбудителей заболеваний для активации защитных механизмов. Конструкция ДНК-вакцин гениально проста: главные компоненты в ней — вектор и целевой иммуноген. Но, несмотря на это, ДНК-вакцины не стоят на страже нашего здоровья: их не вводят пациентам в поликлиниках, они не продаются в аптеках.

Более сотни лет прошло с введения Л. Пастером термина «вакцина» (лат. vacca — корова) и более двух сотен — с легендарных экспериментов Э. Дженнера по прививанию коровьей оспы ребенку с целью предупреждения развития опасного человеческого варианта болезни. Принцип защитного действия введенных в организм ослабленных инфекционных агентов или их частей научным языком объяснили уже в XX веке: безопасный чужеродный антиген учит иммунную систему в дальнейшем быстро распознавать и уничтожать активного и опасного возбудителя с точно такими же антигенами*. Процесс часто сравнивают с раздачей фоторобота преступника сотрудникам полиции.

* — Хронологию разработки вакцин, информацию о влиянии вакцинации на характер эпидемий и численность человечества, доводы адептов движения антивакцинации и ответы на множество животрепещущих вопросов относительно целесообразности, пользы и вреда прививок можно найти в статье «Вакцины в вопросах и ответах» [1]. — Ред.

За 200 лет форма и содержание прививок претерпели существенные изменения: Дженнер инфицировал царапины содержимым оспинных пустул, Пастер облагородил процедуру, вводя ослабленных агентов шприцем, затем научились создавать вакцины из убитых и даже растерзанных возбудителей (сплит- и субъединичные вакцины), недавно начали использовать рекомбинантные вакцины, содержащие один или несколько антигенов (обычно белковых), синтезированных генно-инженерным путем. И вот в двери ВОЗ робко стучится новый плод, порожденный слиянием науки с фарминдустрией, — вакцина из нуклеиновых кислот [2].

Начало ДНК-вакцинологии связывают с работами Д. Танга (1992 г.), в которых была показана способность плазмидной ДНК, экспрессирующей гормон роста человека, индуцировать выработку антител.

В классическом варианте такие вакцины состоят из плазмидных ДНК, содержащих гены возбудителей инфекционных заболеваний (целевые гены, или иммуногены). Продукты данных генов способны вызывать развитие защитных реакций организма, выступая в этом случае в роли антигенов. Доставку ДНК в макроорганизм первоначально осуществляли в комплексе с катионными липидами, однако эффект от введения препарата чистой нуклеиновой кислоты оказался более выраженным. Введенная в организм ДНК проникает в клеточное ядро, превращая клетку в завод по производству вакцины. Такая ДНК длительное время существует вне хромосом без репликации, транскрибируется за счет ферментов хозяйской клетки и экспрессирует соответствующие гены, продукты которых вызывают формирование иммунитета (рис. 1).

Рисунок 1. Схематическое изображение процессов в клетке после проникновения ДНК-вакцины. Рисунок из «Википедии».

ДНК-вакцины сохраняются в организме 3–4 недели. За это время они успевают индуцировать Т- и В-клеточный иммунитет (рис. 2). Однако, несмотря на кажущуюся простоту, многие механизмы развития иммунного ответа на ДНК-вакцины остаются малоизученными [3].

Рисунок 2. Схема развития иммунного ответа на ДНК-вакцину. Рисунок из «Википедии».

Более чем 20-летняя эволюция ДНК-вакцин продолжается и сегодня. Прогресс в дизайне кодирующих антигены нуклеотидных последовательностей, в оптимизации состава (в том числе включение молекулярных адъювантов), в совершенствовании форм и физических методов доставки позволил второму поколению ДНК-вакцин преодолеть такие проблемы первого поколения, как низкий уровень трансфекции и недостаточная иммуногенность.

Сейчас разработки в области генетических вакцин проводятся во многих странах мира. В настоящее время сконструированы экспериментальные ДНК-вакцины для профилактики инфекционных заболеваний паразитарной (шистосомоз, лейшманиоз), бактериальной (хламидиоз, сибирская язва, микоплазмозы) и вирусной (бешенство, лихорадки Западного Нила и Эбола) природы. На разных стадиях доклинических и клинических испытаний находятся генетические вакцины против вирусов гриппа, гепатитов А и В, герпеса, кори, геморрагических лихорадок, ВИЧ, собачьей чумы, ящура, папилломавирусов, цитомегаловирусов. Столь интенсивное развитие данного направления вакцинологии, вероятно, уже в ближайшей перспективе обеспечит реальный выход в виде эффективных и безопасных вакцинных препаратов, рекомендованных для применения в здравоохранении и ветеринарии.

Чем же ДНК-вакцины хороши?

Но. всё хорошее имеет свои недостатки

Конструкция ДНК-вакцин

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного белка, необходимо встроить в вектор, роль которого выполняют бактериальная плазмида или вирус [4]. Вектор не должен реплицироваться в клетках макроорганизма, поэтому может содержать только прокариотические сайты инициации репликации.

Для создания ДНК-вакцин используются хорошо изученные плазмиды грамотрицательных бактерий (в основном E. coli), в частности многокопийная pUC19 или pBR322 и их производные. Разработаны специальные векторы для ДНК-вакцин — pcDNA3 и pcDNA3.1 (Invitrogen), которые содержат цитомегаловирусный (ЦМВ) промотор и сигнал полиаденилирования гена гормона роста быка. Также к коммерчески доступным плазмидам, которые чаще всего используются в качестве векторов для ДНК-вакцин, относятся: pVAX1 (Invitrogen), pCI, VR1012 DNA, pJW4303, pVAC1-mcs и pVAC2-mcs (InvivoGen). Последние две применяются для усиления гуморального иммунного ответа и содержат антигены к поверхностным структурам мышечных клеток [5].

Из числа вирусных векторов, обеспечивающих более высокий уровень экспрессии целевого антигена, чаще всего используются: дефектный по репликации аденовирус серотипа 5 (AD5), ортопоксвирусы и модифицированные вирусы осповакцины, альфавирусы. Аденовирусный вектор обладает высокой эффективностью трансфекции — до 100 %, в него можно включать до 8 т.п.н. ДНК. Отрицательный момент — синтез собственных белков, способных индуцировать иммунный ответ. Самые используемые осповакцинные модификации — Ankara (MVA) и New York Vaccinia strain (NYVAC). Первая получена в результате 56-кратного пассирования вируса в куриных эмбриональных фибробластах. В геноме NYVAC удалено 18 открытых рамок считывания, ассоциированных с диапазоном хозяев и вирулентностью. В каждый из перечисленных векторов можно встроить до 50 т.п.н. ДНК [6].

Элементы конструктора

Рисунок 3. Конструкция ДНК-вакцины на основе вектора pVAX1 с химерным геном (Rat cDNA, Human cDNA). Pcmv — цитомегаловирусный промотор; MCS — сайт для множественного клонирования генов; BGH pA — терминатор с сигналом полиаденилирования гена гормона роста быка; Kanamycin — ген устойчивости к канамицину; pUC ori — участок начала репликации плазмид группы pUC; HindIII, BstEII, XbaI — сайты рестрикции. Рисунок из [5].

Чтобы пригодиться для создания ДНК-вакцин, каждый уважающий себя вектор должен содержать необходимые конструкционные элементы (рис. 3).

Службы доставки

Способам введения ДНК-вакцин в организм уделяется не меньше внимания, чем созданию самих конструкций, так как от этого зависит успех иммунизации в целом. Поэтому разработаны различные, порой весьма хитроумные, методы доставки таких вакцин в организм.

Самый простой — это парентеральный способ введения, который заключается в инъекции ДНК-вакцин в солевом растворе (внутримышечно, внутрикожно). При этом бόльшая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только потом включается в клетки.

Использование генного пистолета. Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1–2 мкм), а затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток (рис. 4). Для данного способа доставки требуется значительно меньшее количество вводимого материала, чем для внутримышечной инъекции. Так, для инъекции мышам нужно 10-100 мкг препарата, а с использованием генного пистолета достаточно 0,1-1 мкг.

Электропорация — техника, которая с использованием электрических импульсов позволяет формировать поры в клеточной мембране и доставлять ДНК непосредственно в клетки.

Микроконтейнеры из полиматериалов. Московские ученые, например, создали пористую микросферу из карбоната кальция, покрытую несколькими слоями полисахаридов, в которую упаковывается молекула ДНК. Если микросферы в полимерной оболочке поместить в подкисленный раствор, карбонат кальция внутри растворится и уйдет через полимерную мембрану. Внутри останется только ДНК, подлежащая транспортировке. Подобных микроконтейнеров для доставки ДНК разработано не так много. Есть зарубежные аналоги, в которых оболочка капсулы выполнена из полимолочной кислоты. На их основе создают вакцины против гепатита и даже СПИДа. Средний диаметр микрокапсул для доставки ДНК-вакцин всего 1–2 микрона. Такие микрокапсулы можно ввести подкожно или даже в кровь. Если в микрочастицу вместе с ДНК или лекарством поместить фермент, расщепляющий оболочку капсулы изнутри, то высвобождением лекарства можно управлять: чем меньше фермента, тем медленнее рушится оболочка.

Липосомные носители обеспечивают высокую эффективность доставки при внутривенном введении, при этом экспрессия целевых генов значительно возрастает, так как осуществляется во многих органах, и особенно в селезенке.

ДНК-вакцины можно вводить перорально с использованием бактериальных носителей. Для этих целей применяются, например, модифицированные бактерии Shigella flexneri с делецией в гене asd. Мутантные бактерии растут in vitro на среде с диаминопимелиновой кислотой и, проникая в эукариотические клетки, не размножаются в них, так как отсутствует упомянутая кислота, а продуцируют закодированные в плазмиде антигены [6]. Для перорального введения создан вектор на основе ослабленного штамма Salmonella, который способен к самоуничтожению в организме через определенный период времени после выполнения иммунизационных задач. Для этого бактерию модифицировали таким образом, что ее выживание стало зависеть от наличия искусственных сахаров, не встречающихся в условиях организма. После того как в клетках, зараженных генно-инженерным штаммом Salmonella, заканчивается запас специфического сахара, поставляемого вместе с вакциной, бактерии не способны сохранить целостность своих клеточных стенок, что приводит к их гибели [11].

Была предложена оригинальная система доставки ДНК с помощью «теней» — неживых клеток грамотрицательных бактерий, лишенных цитоплазматического содержимого, но сохраняющих морфологию и антигенные структуры, включая адгезивные факторы. «Тени» обладают тропностью к антигенпрезентирующим клеткам макроорганизма и адъювантными свойствами, усиливающими иммунный ответ. Кроме того, в лиофильно-высушенном состоянии препараты «теней» хранятся при комнатной температуре неопределенно долгое время, а их производство дешево [6].

Разработана технология доставки ДНК-вакцин с использованием бактериофагов [12]. В данном случае вакцинная ДНК встраивается в геном вектора-бактериофага, которым затем иммунизируют макроорганизм [13].

Нужно учитывать, что разные методы доставки ДНК-вакцин в организм обеспечивают развитие различных клеточных реакций, при этом важные иммунологические пути могут быть стимулированы или, наоборот, не задействованы в ходе развития защитного ответа. Способы и места введения ДНК-вакцин варьируют для разных видов организмов. Например, уши свиньи — отличное место для инъекций, а вот введение препарата в уши овец или коров неэффективно.

Помощники генетических вакцин

Для усиления иммунного ответа, вызванного ДНК-вакцинами, совместно с ними вводят различные адъюванты, например, плазмиды, кодирующие синтез цитокинов, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и других костимуляторных молекул (B7.1 (CD80), B7.2 (CD86) и CD40) [14].

Для ДНК-вакцины против ВИЧ создана конструкция, которая обеспечивает получение более высокого титра антител и его сохранность в течение более длительного времени по сравнению с обычной ДНК-вакциной. Эта молекулярная вирусоподобная конструкция представляет собой частицы диаметром 25-30 нм, содержащие в центре полинуклеотидный комплекс — рекомбинантную плазмиду pGEX-2T-TBI с генами инфекционного агента ВИЧ-1 или двухцепочечную РНК, которая является стимулятором неспецифической резистентности организма. На поверхности конструкции располагаются гибридные белки, содержащие эпитопы ВИЧ-1 и фермент (например, глутатион-S-трансферазу или галактозидазу). Связь между полинуклеотидным комплексом и гибридными белками осуществляется посредством конъюгата: спермидин (для связи конъюгата с полинуклеотидным комплексом) — полиглюкин — субстрат для фермента (например, глутатион или галактопиранозид; для аффинной сорбции гибридных белков на конструкцию).

Современное состояние ДНК-вакцинологии

В настоящее время в разработке находится около 420 ДНК-вакцин против заболеваний различной этиологии как человека, так и животных.

Бόльшая часть разрабатываемых противоинфекционных терапевтических ДНК-вакцин нацелена на ВИЧ-1. Существенные успехи достигнуты в активной иммунизации против вируса папилломы человека. Некоторые вакцины находятся на стадии клинических испытаний и, возможно, в скором времени будут введены в обязательную практику. Так, американская компания Inovio, специализирующаяся на разработке ДНК-вакцин, создала препарат против цервикальной дисплазии VGX-3100, который проходит вторую фазу клинических испытаний. В 2013 г. VGX-3100 удостоилась награды «Лучшая терапевтическая вакцина» на Всемирном конгрессе по вакцинам. В I или IIа фазах клинических испытаний находятся: вакцины против гепатита С, цервикального рака, рака головы и шеи, СПИДа, гриппа. Компанией Inovio также ведется активная разработка вакцин против лихорадки Эбола* и рака простаты.

* — О более привычном, но не менее перспективном методе борьбы с вирусом Эбола — с помощью «коктейля» из моноклональных антител — читайте в статье «Вирус Эбола и макак-резус: получено новое эффективное лекарство» [15]. — Ред.

Разработке способов вакцинотерапии онкологических заболеваний при помощи рекомбинантных ДНК большое внимание уделяют и другие организации. Хорошую эффективность показала ДНК-вакцина против лейкемии, созданная в Саутгемптонском университете (но вводимая с помощью электропоратора всё той же Inovio). Вакцина направлена на подавление в организме активности гена WT1 (Wilms tumor gene). Именно повышенная активность этого гена отмечается в опухолевых клетках различных видов. В ходе I фазы клинических испытаний у пациентов наблюдалось развитие иммунного ответа, в том числе активация Т-киллеров и выработка антител; была также доказана безопасность новой вакцины. Испытания перешли в фазу II, однако из-за проблем с финансированием организаторы пока не могут увеличить число участников [16].

Животные нуждаются в такой же защите, как и люди. В связи с этим для ветеринарии разрабатываются ДНК-вакцины против бычьего и лошадиного герпесвирусов, собачьего вируса чумы, вируса классической свиной лихорадки, кроличьей папилломы, ящура, вируса инфекционного гемопоэтического некроза, вируса гриппа, вируса японского энцефалита, вируса бешенства, вируса везикулярного стоматита и т.д. [13]. Много ДНК-вакцин создается для борьбы с вирусными, бактериальными и эукариотическими патогенами рыб [17].

Активно разрабатываются ДНК-вакцины для повышения иммунитета птиц. Многокомпонентные ДНК-вакцины могут сократить количество прививок, необходимых во время короткой жизни птиц и позволят избежать риска увеличения вирулентности некоторых патогенов. В случае птицеводства проблема связана с тем, что вакцины вводятся в амниотическую жидкость яиц, которая обладает ДНКазной активностью, поэтому свойства ДНК-вакцины могут ухудшиться. Заключение ДНК в катионные липосомы, скорее всего, поможет решить эту проблему.

Из множества разработанных ДНК-вакцин на сегодняшний день лицензировано всего несколько, причем повезло в этом плане только животным (табл. 1).

Источник